ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS


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1 ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS Las actividades relacionadas con cultivo in vitro de tejidos deben realizarse en ambientes asépticos, con iluminación y temperatura controladas, para asegurar la optimización de las respuestas del material, tanto cualitativas como cuantitativas, a estímulos termo y fotoperiódicos. El elevado grado de asepsia es una condición indispensable, ya que hongos, levaduras y bacterias proliferan en los mismos medios de cultivos utilizados, impidiendo el crecimiento del material vegetal en estudio, por contaminación y agotamiento del medio. Los requerimientos enunciados se tornan más limitantes a medida que el tamaño del laboratorio aumenta, ya que con el incremento de las actividades crece también el riesgo de contaminación. Una forma de garantizar mayor asepsia es compartimentalizar las actividades dentro del laboratorio, separando las áreas donde se trabaja con material contaminado de aquellas que incluyen material estéril y que requieren de ambientes más asépticos. En estas últimas se debe evitar la circulación innecesaria de personas. Hay que señalar que la capacidad de producción de un laboratorio de cultivo de tejidos está determinada por el tamaño de la cámara de cultivo, siendo las demás dependencias accesorias y destinadas a la preparación de medios de cultivo y acondicionamiento previo del material vegetal. Por tanto, cuando se diseña un laboratorio de estas características, se debe comenzar por dimensionar la cámara en función de la producción diaria, mensual o anual. ESTRUCTURA DEL LABORATORIO: Las actividades a desarrollar en un laboratorio de cultivo de tejidos se pueden agrupar de la siguiente manera: 1-Sala de limpieza: En este lugar se realizan las tareas de eliminación de residuos, limpieza del material de vidrio, autoclavaje de agua, de medios de cultivo y utensilios varios. Está dotado de mesadas de trabajo, instalación de agua corriente y gas, electricidad, desagües, armarios para almacenar material de vidrio limpio, piletas de lavado, autoclave, destilador, desionizador, lavador de pipetas, horno de microondas (opcional), lavavajillas (opcional), estufa de secado. 2-Sala de preparación: Este lugar está destinado a la preparación de soluciones diversas, de los medios de cultivo, a sí como el acondicionamiento previo del material vegetal

2 destinado a cultivo in vitro. Es el lugar de mayor circulación de personas y en donde debe calcularse una puerta de entrada suficientemente grande para la entrada de la campana de flujo laminar. Está equipado con mesadas, armarios de diversos tamaños para almacenar reactivos, material de vidrio, medios de cultivo, heladera, freezer, balanza analítica, agitador magnético, peachímetro, instalación de agua, electricidad y gas. 3-Sala de transferencia: Es el lugar donde se manipula asépticamente el material vegetal. Debe ser un lugar exclusivo para la instalación de la campana de flujo laminar y estanterías destinadas al almacenamiento temporario de envases con medio de cultivo y otros materiales esterilizados destinados al uso inmediato. Instalación de lámpara Ultravioleta. Esta área debe ser de acceso restringido, en lo posible con puerta vidriada, para permitir la comunicación visual con las área de preparación y de cultivo, evitando la circulación innecesaria de personas. En zonas cálidas es preferible contar con aire acondicionado. 4-Sala de cultivo: Es el área donde los cultivos se mantienen hasta el momento de retirarlos de los frascos (rusticación). Las paredes de la sala y las estanterías serán de material que permita su fácil limpieza y desinfección. La iluminación se logra verticalmente, desde el techo del estante superior, o lateralmente desde la pared, por medio de tubos fluorescentes, cuyas reactancias deben ser colocadas fuera de la cámara para no aportar calor adicional. El fotoperíodo es mantenido a 16 h por medio de dispositivos electrónicos, con una irradiancia próxima de 60 nmol m -2.seg. -1. Cuando algún cultivo requiere oscuridad se cubre con tela negra o es colocado dentro de cajas herméticas. La temperatura se fija en 27ºC (dependiendo de la especie), por medio de equipos de aire acondicionado. En el mismo cuarto de cultivo debe instalarse los agitadores orbitales (shaikers), necesarios para algunas prácticas especiales. Es aconsejable que los controles de temperatura se sitúen fuera del cuarto y que alguna puerta del mismo posea visor de vidrio para permitir la observación externa y limitar la entrada de visitantes. Otras dependencias: La instalación de compartimentos de apoyo a las actividades principales, como invernaderos, escritorios, instalación sanitaria y depósitos está condicionada al tamaño y tipo de actividades desarrolladas en el laboratorio. Cuando la actividad principal es la investigación, la cantidad de material manipulado es escasa en comparación con un laboratorio comercial. En este último caso debe preverse la instalación de cámaras de niebla asépticas, semicubiertos de media-sombra e invernaderos capaces de albergar el material durante la aclimatación y hasta el momento de su comercialización.

3 EQUIPAMIENTO: Agitador magnético Agitador orbital Aparato para vacío Autoclave Balanza de precisión Balanza granataria Campana de flujo laminar Carrito de laboratorio Desecador Desionizador Destilador Dispensador de medios de cultivo Esterilizador de instrumental Estufa de secado Freezer Heladera Lavadora de pipetas Lavavajillas Lupa binocular Mechero de Bunsen Medidor de ph Microscopio estereoscópico Utensilios varios Algodón Frascos de cultivo Frascos para agua destilada Frascos para reactivos Material de vidrio (pipetas, buretas, erlenmeyers, cajas de Petri, etc.) Papel de aluminio Parafilm Pisetas Soporte de tubos de ensayo Termómetros

4 Autoclave: La esterilización de tanto del material como de los medios de cultivo, se efectúa con calor húmedo en unos aparatos denominados autoclaves. El autoclave es en esencia, un recipiente en el que se consigue exponer el material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullición del agua, gracias a aumentar la presión. El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de diferentes fases: - Fase de purgado: a medida que la resistencia calienta el agua, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir por la válvula de purgado que esta abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización. - Fase de esterilización: una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización que se extiende por un tiempo previamente determinado (20 min. A 1 atm. ) - Fase de descarga: finalizada la fase anterior deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presión y temperatura comienzan a bajar poco a poco.

5 Cámara de flujo laminar: Para disponer de una superficie de trabajo estéril que no ponga en peligro a los cultivos se usan las cámaras de flujo laminar. Una cámara de flujo laminar es un receptáculo con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue porque se hace circular a través del interior de la cámara una corriente de aire que previamente ha sido microfiltrada para eliminar toda partícula extraña. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cámara de flujo sin pasar previamente por los filtros se procura que la presión interior sea ligeramente superior a la presión exterior, con lo cual el aire siempre circula de adentro hacia fuera y nunca al revés. Existen dos tipos de cámaras de flujo laminar según sea la forma en la que se hace circular el aire: cámaras de flujo horizontal y cámaras de flujo vertical.

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